Потребителски вход

Запомни ме | Регистрация
Постинг
05.04 08:46 - „Правене на нещо от нищо“: PCR тестове, CT стойности и фалшиви положителни резултати
Автор: zahariada Категория: Други   
Прочетен: 142 Коментари: 0 Гласове:
3

Последна промяна: 05.04 08:50


  „Правене на нещо от нищо“: PCR тестове, CT стойности и фалшиви положителни резултати

Коментар за ефикасността на RT-PCR теста с оглед на хартията Jaafar. Нилс Харит доктор

image

РЕЗЮМЕ: Ако инокулацията може да се използва като проверка на теста Corman-Drosten RT-PCR за Covid-19, около 50% от докладваните положителни резултати трябва да се считат за неверни, когато се прилагат максимум 35 цикъла. Ако се прилагат само 25 цикъла, фракцията на фалшивите положителни резултати спада до 20%.

Ефикасността на RT-PCR теста, използван за идентифициране на инфекция от вируса SARS-CoV-2 и "случаи" на болестта Covid-19 е широко оспорвана. В тези дискусии често се твърди, че тестът дава 97% фалшиви положителни резултати. Позоваването на това твърдение е направено на проучване от базирана в Марсилия група, която съобщи резултатите си в писмо до редактора на 28 септември 2020 г. [ 1 ]

Първият автор е Р. Джафар, така че оттук нататък се нарича Джаафар-хартия. Той представлява разширен набор от данни в сравнение с по-ранно проучване [ 2 ], ръководено от B. La Scola. Тази публикация се нарича хартия на La Scola.

В обобщение, резултатите, представени в Jaafar-хартията, не предоставят самостоятелно доказателство за теста, който дава 97% фалшиви положителни резултати. Настоящият коментар е опит да се дестилират основните заключения от техните данни.

В полу-публичното достояние беше друго объркване, че съкращението „RT-PCR“ понякога се нарича „верижна реакция на обратна транскриптаза полимераза“, докато в други случаи може да се види, че се обяснява като „PCR в реално време“ .

И двете са. Това е RT-PCR в реално време.

Ензимът обратна транскриптаза адресира едноверижни РНК фрагменти в тампона и ги превръща в двуверижна ДНК в поредица от стъпки. След това ензимът полимераза започва да прави копия на избрана ДНК. Изборът се определя от двойка т. Нар. Грундове, които са необходими за започване на процеса.

Репликацията се извършва на цикли. Всеки цикъл започва с нагряване на пробата, за да се отдели двойната спирала на ДНК на две свободни ДНК вериги. Те служат като шаблони за полимеразата, за да произведат допълващи нишки на всеки от градивните блокове, присъстващи в супата. След охлаждане нишките се рекомбинират. Цикълът приключи. Резултатът е удвояване на броя на наличните ДНК молекули преди цикъла.

По време на производството ДНК се маркира от сондираща молекула, която флуоресцира само когато е включена в ДНК. По този начин пробата излъчва видима светлина, когато се облъчва с малко лазер. Интензивността на флуоресценцията се записва за всеки цикъл на PCR като мярка за количеството произведена ДНК. Тук влиза реалното време. Когато се достигне предварително определено ниво, процесът на умножение се спира и тестът се нарича „положителен“.

Броят на циклите, необходими за получаване на критичното ниво на флуоресценция, се нарича праг на цикъла, Ct, което е характеристика на всяка проба. Очевидно е, че ако процесът започне с огромен брой РНК-фрагменти, праговата интензивност на флуоресценция се достига рано и Ct е ниска. Ако първоначалното натоварване е само на няколко РНК молекули или може би дори на едно парче, може да са необходими много цикли, за да се получи критичният флуоресцентен сигнал.

Това означава, че стойността на Ct има потенциал да осигури количествена мярка за вирусния товар на всеки човек. Може да бъде удобно, ако искате количествена мярка за вашето временно състояние.

Един бъдещ разговор може да върви по следния начин:

"Как си?"

„Отидох в тестовия център. Казаха ми, че се чувствам добре. Днес имам Ct от 42. "

Както ще се разбере от по-долу, този обмен може да означава, че човек №2 е бил настинал миналата есен, но днес няма клинични симптоми.
Всички проби са положителни, ако се прилагат 60 цикъла, защото „PCR прави нещо от нищо“, както веднъж каза Кари Мълис - изобретателят на Нобелова награда за технологията PCR.

Когато става въпрос само за цикли, преди тестът да е положителен, всички ние трябва да имаме ДНК и / или РНК фрагменти - чужди или местни - в нашето тяло, които са насочени от праймерите в настоящата употреба. При високи стойности на Ct в крайна сметка усилвате "фоновия молекулярен шум" на доброкачествените генетични фрагменти.

НИЕ ВСИЧКИ ИМАМЕ CT ПРЕЗ ЦЯЛОТО ВРЕМЕ!

Докладът Jaafar е принос към важното обсъждане на терапевтичната полезност на методологията PCR. По-конкретно: „Каква е преломната точка за Ct, под която PCR осигурява смислен тест за Covid-19 и над който е безсмислен“?

От началото на огнището на Covid-19 до завършването на изследването в посочената публикация институтът в Марсилия извърши 250 566 теста за SARS-CoV-2 за 179 155 пациенти.

От тях 13 161 са положителни в рамките на 35 цикъла на RT-PCR. Това е 7,3%.

От тези положителни проби, 3790 бяха инокулирани и управлявани за култура. Процесът на инокулация е горе-долу описан в хартия La Scola

Те пишат, че „0,5 ml течност за тампони се центрофугира и инокулира върху VERA клетки (клетъчна линия на маймунски бъбреци) и се наблюдава за цитопатогенен ефект“ - за неразкрит брой дни.

Тоест, клетките са умрели и са се разпаднали? Това наблюдение трябва да е направено под оптичен микроскоп. Ако те наблюдават клетъчна смърт, от флакона се взема течна проба и се обработва съответно за наблюдение в сканиращ електронен микроскоп.

Авторите наричат ​​това „предполагаемо откриване на вирус в супернатанта, показващ цитопатогенен ефект.“

В превод това означава: „Ако видим, че клетките на маймуната умират и се разпадат в оптичния микроскоп, вземаме пробата до електронния микроскоп и вярваме, че каквото и да видим там, трябва да е вирусът.“

Не са предоставени обаче снимки с електронен микроскоп.

Наличието на вирус допълнително се "потвърждава" с RT-PCR върху споменатата течност. Много важно е, че стойностите на Ct за тези RT-PCR, проведени върху пробите, подложени на електронна микроскопия, не са предоставени. Ако ДНК / РНК, избрани от праймерите преди и след инокулацията, са насочени към същия вирус, последният Ct трябва да бъде значително по-нисък от Ct, получен от суровите тампони.

Ако не бяха, наистина не знаем защо клетките умряха.

Но нека приемем засега, че клетъчната смърт е критерий за успешна инокулация и че смъртните случаи са причинени от същия вирус, който се определя количествено в RT-PCR теста.

По този начин Jaafar et al. съобщават, че инокулацията е била успешна през 1941 г. от 3790 положителни PCR, управлявани за култура.
Това ни води до непосредствената оценка, че 49% от положителните PCR тестове може да са били фалшиви в смисъл, че вирусният товар на пациента трябва да е бил незначителен.

Дали 51% успешно инокулираните проби представляват положителна диагноза за заболяването, наречено Covid-19, зависи от това дали SARS-CoV-2 наистина е единична единица и дали е изолиран и показан като патоген на заболяването.

Следователно в тази оценка ние запазваме термина „положителен“ за проба, достигаща критичния праг на флуоресценция. „ Позитивите “ включват инокулируемите и не инокулируемите проби (които са фалшиви положителни резултати).

Данните от Jaafar-хартията са възпроизведени на Фигура 1. Тя показва разпределението между инокулируеми и не инокулируеми проби за всяка група Ct, вариращи от 11 (Ct11) до 37 (Ct37) цикъла.

Вярно е, че инокулируемите съдържат само 3% от Ct35-групата. Но тъй като трябваше да бъдат взети само 74 проби дотук, това не означава, че RT-PCR тестът дава общо 97% фалшиви положителни резултати. Картината е по-разнообразна.

image


Фигура 1. От Jaafar et al. Показва инокулируеми проби (кафяви) заедно с не инокулируеми (сиви) за всеки Ct.

Същите данни се показват по по-традиционен начин на Фигура 2.

image

Фигура 2. Същите данни като Фигура 1, показвани традиционно. Черната линия представя колко проби са подложени на клетъчна култура при всяка Ct-група.

Търсим отговор на въпроса: Колко цикъла трябва да бъдат стандартни, ако искаме 80% от положителните да представляват инокулируема проба?

image

Фигура 3. Вляво: Интегриране на криви #inculables и # non-inculables на Фигура 2. Тоест, сума от съответно инокулируеми и неинокулируеми, регистрирани до даден Ct. Вдясно: Същото, като процент от сумата на култивираните проби при Ct.

На фигура 3 (вляво) броят на инокулируемите и не-инокулируемите, съответно, се сумира до стойността на Ct. Тоест кривите на фигура 2 са интегрирани.

На фигура 3 (вдясно) се показват същите данни като процент от общия брой култивирани проби до този Ct.

Вижда се, че при Ct25 80% от пробите, наречени „положителни“ от RT-PCR теста, ще бъдат инокулирани. Въпреки това, 20% от „положителните резултати“ ще бъдат неверни, ако инокулацията е еталон за ефикасност на RT-PCR. Някои може да счетат това за справедлив компромис.

Така че, ако 1) съществува такова нещо като единичен вирус SARS-CoV-2, ако 2) този вирус причинява сериозни респираторни симптоми, ако 3) вирусът е инокулируем във VERA клетки, ако 4) VERA клетки са валидно представяне на човешкото дито и ако 5) тестът на Корман-Дростен наистина открива SARS-CoV-2, МОЖЕ да има известна полза за лекар в клинична обстановка с пациент със сериозни респираторни симптоми, за да се проведе RT-PCR, докато Ct = 25 като допълнителен тест. [ 3 ]

Малко далеч, нали?

Наистина се свежда до грундовете, тяхната специфичност и приложимост при ниски концентрации. Как могат да се насочат към фатален вирус SARS-CoV-2, след като самото му съществуване остава да бъде доказано ? Освен това последователностите на различните използвани праймери се намират не само в ок. 100 бактерии, но те също са в изобилие в човешкия геном. [ 4 ] [ 5 ]

Сдвояването на две ДНК вериги - хибридизация - не трябва да е идеално, за да се случи. Ако двете направления са, да речем, само 80% допълващи се, константата на свързване ще бъде намалена. Но хибридизацията се случва въпреки това. Когато се използва силно преувеличена концентрация на праймери в стандартния тест на Corman-Drosten [ 6 ], той умишлено е обвързан с друга ДНК, плаваща наоколо, независимо дали те са произведени от обратната транскриптаза или не. [ 7 ]

ИЗПИТВАНЕ НА RT-PCR ТЕСТ НА CT25

Какъв резултат може да се очаква, ако тестът на Корман-Дростен е открил нещо, наречено SARS-CoV-2 и е бил експлоатиран при максимум 25 цикъла?

image

Фигура 4. Вляво: Сума от RT-PCR позитиви, управлявани за култура до Ct-групата (интегриране на черна линия на фигура 2). Вдясно: Показват се същите данни като% от общата сума положителни резултати, управлявани за култура (3790).

Помислете на фигура 4 (вляво) как общият брой култивирани проби се увеличава частично линейно с броя на циклите. Това е в съгласие с идеята, че броят на култивираните на Ct-група достига плато отвъд Ct ~ 20 (фигура 2), но заслужава внимание само ако подборът на проби, подложени на култура, е случаен.

От тази подгрупа (3790), подложени на култура - избрани сред онези, които се определят като положителни чрез RT-PCR теста в рамките на 35 цикъла - само 1813 биха били регистрирани като положителни, ако бяха приложени само 25 цикъла (Фигура 4, вляво), съответстващи на 48% от подгрупата (Фигура 4, вдясно).

Тъй като 7.3% са тествани положително чрез RT-PCR в рамките на 35 цикъла, може да се очаква, че 7.3 x 0.48 = 3.5% ще бъдат върнати като положителни, ако броят на циклите е ограничен до 25.

От тях 2,8% могат да бъдат надеждни (80% според инокулацията), докато 0,7% може да са фалшиви положителни - АКО инокулацията е валидно средство за потвърждение и всички други условия са изпълнени!

ЗАКЛЮЧИТЕЛНА БЕЛЕЖКА

Да си болен означава да имаш симптоми. Ако не сте болни, не сте заразни. Преди беше здравият разум, че сте здрави, освен ако не сте.

Усетът вече не е често срещан по време на предполагаемата пандемия Covid-19. Сега сте болни, докато се докажете, че сте здрави - и сте заразни по подразбиране. Превозното средство за тази измама е RT-PCR тест, изпълнен при> 35 цикъла и повече. Спрете тестването и оцелете.

Нилс Харит е доцент по химия (пенсиониран) в университета в Копенхаген. Той е първият автор на новаторската хартия Активен термичен материал, открит в прах от катастрофата на Световния търговски център от 11 септември



Гласувай:
3
0



Спечели и ти от своя блог!
Няма коментари
Търсене

За този блог
Автор: zahariada
Категория: Политика
Прочетен: 30250606
Постинги: 17805
Коментари: 20117
Гласове: 27008
Архив
Календар
«  Април, 2021  
ПВСЧПСН
1234
567891011
12131415161718
19202122232425
2627282930